上一篇《關(guān)于美白那些事兒》推文中講到，皮膚變黑的影響因素有很多，為達(dá)到美白效果，我們可以通過不同的生物化學(xué)通路抑制或調(diào)節(jié)黑色素的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，如抑制酪氨酸酶活性、干擾黑色素合成、阻斷黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)、加速黑色素分解以及抗氧化和抗炎作用等。那么接下來，就讓我們一起來看看依據(jù)不同抑制途徑構(gòu)建的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型及祛斑美白功效評估方式吧！
1.酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)
酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶，它催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素的前體。抑制這一酶的活性可直接減少黑色素產(chǎn)生。采用生化反應(yīng)法可測定酪氨酸酶活性抑制率。
圖1 酪氨酸酶活性抑制率
隨著樣品濃度的升高，酪氨酸酶活抑制率逐漸上升，樣品具有良好的美白祛斑功效。
參考標(biāo)準(zhǔn)：T/SHRH 015-2018化妝品-酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)方法
2.酪氨酸酶活性和黑素含量測定（B16-F10）
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圖2 酪氨酸酶活性抑制率 圖3 黑素含量
樣品組酪氨酸酶活力顯著下降，黑素含量減少，表明樣品具有良好的美白祛斑功效。
黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和人A375黑色素瘤細(xì)胞模型通常被用于實(shí)驗(yàn)。小鼠B16細(xì)胞因能夠多次傳代、生長速度快和對培養(yǎng)條件要求相對較低等特點(diǎn)，成為美白功效評估的優(yōu)選細(xì)胞。但該細(xì)胞與人體內(nèi)的黑素細(xì)胞仍存在一定差異，且多次傳代后產(chǎn)黑素能力下降。通常需采取重新引種、體內(nèi)成瘤再培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件、基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染表達(dá)黑素合成關(guān)鍵酶的基因等方式恢復(fù)其高表達(dá)狀態(tài)。因此，B16細(xì)胞常用于初步或高通量篩選，但在最終應(yīng)用于人類前，還需通過人類細(xì)胞或臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。
A375細(xì)胞來自于人類黑色素瘤，其生物學(xué)特性和變化更能反映人類細(xì)胞的實(shí)際響應(yīng)，對研究黑色素生成和美白成分的功效具有重要意義；疾病相關(guān)性更高，使用這些細(xì)胞進(jìn)行的研究更具臨床相關(guān)性，尤其在探索可能的治療方法或美白機(jī)制方面；使用人類細(xì)胞可以更準(zhǔn)確地評估藥物的效果和安全性，更好地模擬藥物在人體內(nèi)的作用。但A375細(xì)胞的培養(yǎng)條件更苛刻，成本較高，實(shí)驗(yàn)操作更復(fù)雜。
圖4 體外正常培養(yǎng)的B16黑色素瘤細(xì)胞和A375黑色素瘤細(xì)胞（A: B16F10; B: A375）
3.黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)測定（B16-F10）
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圖5 黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)測定
樣品組黑素細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，表明樣品具有良好的美白祛斑功效。
4.黑色素瘤細(xì)胞樹突長度和數(shù)量測定（MNT-1）
黑色素細(xì)胞樹突數(shù)量增加，樹突長度變長，會(huì)促進(jìn)黑色素向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如果測試物對這種情況有抑制，則樹突數(shù)量會(huì)減少且長度變短。
圖6 黑色素瘤細(xì)胞樹突長度和數(shù)量測定
隨著濃度的增加，黑素細(xì)胞樹突數(shù)量減少長度變短，樣品具有良好的美白祛斑功效。
黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
黑素傳遞是皮膚中黑色素細(xì)胞（Melanocytes，MC）與角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocytes，KC）之間的一個(gè)關(guān)鍵過程，它涉及黑素從MC轉(zhuǎn)移到KC，以保護(hù)皮膚免受紫外線（UV）輻射的傷害。首先，黑素細(xì)胞在其黑素體（一種特化細(xì)胞器）中合成黑素，此過程主要受到酪氨酸酶（Tyrosinase）和其他相關(guān)酶的催化；黑素合成后，黑素體會(huì)在黑素細(xì)胞內(nèi)成熟并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞末梢（依賴于細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)和相關(guān)運(yùn)輸?shù)鞍祝浑S后，黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞通過其突起（或稱黑素細(xì)胞突觸）形成物理接觸。黑素體通過這些突起被運(yùn)送到與角質(zhì)形成細(xì)胞的接觸點(diǎn)，通過“細(xì)胞吞噬”（Cytocytosis）過程釋放到角質(zhì)形成細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞通過一種類似于吞噬的機(jī)制（可能涉及內(nèi)吞作用）接收黑素體。一旦進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞，黑素體被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核周圍，形成保護(hù)屏障，幫助屏蔽DNA免受紫外線引起的損傷。
在人體內(nèi)部，一個(gè)黑色素細(xì)胞（MC）能夠與10至36個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）建立聯(lián)系，并向它們傳遞黑素。在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過調(diào)整兩種細(xì)胞的培養(yǎng)比例，將永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT與人類黑色素瘤細(xì)胞MNT-1共培養(yǎng)構(gòu)建體外“表皮黑素單元”模型，可用于研究黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的交互作用，評估產(chǎn)品美白效果。
圖7 體外正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞和MNT-1黑色素瘤細(xì)胞（A: HaCaT; B: MNT-1）
5.黑色素轉(zhuǎn)移測定（HaCaT- MNT-1共培養(yǎng)，IF）
圖8 熒光染色黑素轉(zhuǎn)移測定
樣品組紅色熒光強(qiáng)度下降，表明黑色素轉(zhuǎn)移受到抑制，樣品具有良好的美白祛斑功效。
6.黑色素轉(zhuǎn)移測定（HaCaT-黑素小體共培養(yǎng)）
在體外評估美白產(chǎn)品的功效時(shí)，使用黑素小體（melanosomes）和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)的方法是可行的。黑素小體是黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)黑色素。通過將這些黑素小體直接與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)，可以模擬黑素從黑色素細(xì)胞到角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，直接評估美白成分對黑素小體的影響，如抑制黑素的吞噬或影響其在角質(zhì)形成細(xì)胞中的分布和穩(wěn)定。
但黑色素細(xì)胞不僅僅是黑素的生產(chǎn)單位，它們還參與許多調(diào)控過程，如黑素的合成、成熟、分泌等。僅使用黑素小體可能無法完全復(fù)制這些復(fù)雜的生物學(xué)過程。黑素小體需要從黑色素細(xì)胞中提取，這一過程復(fù)雜且難以標(biāo)準(zhǔn)化，黑素小體的質(zhì)量和活性可能因提取方法而異。
圖9 黑素轉(zhuǎn)移顯微鏡圖
給予黑色素粗提物后細(xì)胞中明顯可見黑色素的存在，并分布于細(xì)胞核周圍，形成“核上帽”，增加裂解的黑色素細(xì)胞數(shù)量可以獲得更多黑色素體，并使角質(zhì)形成細(xì)胞中黑色素量增加，轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果更顯著。
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